[LAMP反应为什么引物设计是两对引物判断标准是什么]一般使用primer5就挺好，不知道你是扩基因还是启动子，基因是否是已知。 PCR引物设计原理： PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此...+阅读

引物可以通过一些软件设计，比如primer 5 ，但是还需要注意一些细节问题。 比如 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

怎样设计RT PCR引物

Oligo dt不需要设计，用试剂盒里面的就行。如果你RT的引物想用自己的，那你需要扩增的基因序列应该是明确的吧。RT的时候'引物没太多的选择性，mRNA序列跟反义链配对，因此RT的引物要根据正义链 （就是通常描述基因序列的那条链）3'末端往5'末端的顺序来合成。需要注意通过控制引物的长度，控制Tm，毕竟反转录反应都在42℃进行的。 PCR用的引物建议使用primer primer等软件来设计。首先自己估算你目标条带的Tm值，然后在软件里面设定引物的Tm为目标的Tm附近，通常引物与模板配对区长度在20-25bp，扩增长度超过10k的话引物中与模板配对的要延长到30bp或更长，扩增长度、自由能、二聚体等要求就按照软件列出做填空就行了。最后，软件会给出一些引物对选择，你自己选择上下游引物Tm差值小的、二聚体和cross dimer以及false priming情况可以接受的那对引物组合。

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如何设计RTPCR引物呢请大侠们帮忙说具体一些

是做反转录还是real time PCR?

反转录的话，可以用oligoT做反转录的引物，得到全部的cDNA，然后再利用特异性的引物去扩增出目的基因。或者直接用特异性的引物去反转录出来目的基因的cDNA，然后再进行PCR扩增。

引物设计的话，跟平常的引物设计应遵循的原则差不多。不过由于是扩增目的基因的coding sequence，所以引物设计的时候只能从coding sequence的两端设计，这样才能得到全长的目的基因。设计时，除了要与cDNA互补的一段外，还需要另外添加Kozac序列和酶切位点序列以及保护碱基，这样扩增出来的PCR产物就可以直接进行酶切连接，连入相应的载体上了。

real timePCR的话，同样根据需要扩增的片段设计引物就行了，没有位置的限制。

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