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自行设计一对引物，从质粒pUC18上扩增一段无启动子和信号肽的β-内酰胺酶基因（△P△SPAmp），经pGEM-T-EASY载体克隆到pET- 28衍生质粒pKan的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ间，得到在Kan平板中生长而在Amp和Kan双抗平板中不能生长的转化子pMBL-E质粒.经部分酶切补平自连，筛选得到消除Hind Ⅲ位点端EcoR Ⅰ位点的质粒，即为用于输出信号基因片段捕获的目的载体pMBL，大小为3.46kb.经酶切鉴定和测序分析，表明构建的载体与预期设计的一致，并应用四环素抗性基因（Tet'）对载体的有效性进行了验证，证明构建的载体pMBL能有效捕获含启动子和信号肽序列的输出蛋白编码基因.

如何设计引物

一般是通过设计软件，例如oligo6,primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比较容易的。

至于设计引物的一般原则如下：

* 序列选取应在基因的保守区段

* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

* Tm值在55-65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%-60%

* 引物之间的TM相差避免超过2℃

* 引物的3'端避免使用碱基A，引物的3'端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基

* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

* Taqman探针PCR要求片段长度在80bp-150bp

* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

能不能指点一下简并引物怎么设计

① 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。② 产物不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。⑥引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑦引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。

一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。⑧ 引物5′端可以修饰。引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 ⑨ 引物3′端不可修饰。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3′端不能发生错配。 ⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。...

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