[如何用英语请客]Friends like to treat each other当你想请别人吃一个冰淇淋时，该如何说呢？很简单，只要一句“I'll treat you to ice cream.”就行了。这天，Susan就请她的中国朋友Maymay和Lin...+阅读
首先打开软件 左上角来操作 file——new——dna sequence 这一项可以把你复制的序列粘贴进去 当然，你也可以选择另一个 file——open——dna sequence 去open一个新的文件。在接下来的界面里 复制你的序列，于是就将序列导入了点击search 进入下图界面开始设计引物 在此图中有6个部分，红色数字标示 1区，包括三部分，可以选择设计pcr引物，测序引物和杂交探针 2区，搜寻模式，包括正链，反链等，我们一般选最后一项pairs，出来一组引物 3区，引物的范围，上游引物所在范围，下游引物所在范围 4区，pcr 长度，根据需要设置 5区，引物长度，这个是调整的重点，前面是长度，后面是± 6区，选择模式，一般选auto，也可以手动下面是一个设计 我选择了 正链位于1-400内 负链位于500-910内 产物长度100-600 引物长度为20±1bp 输入后，出现下图界面 共有1000多条引物 点击ok
谁有半定量RTPCR的方法步骤谢了急用
1、原位PCR步骤 1）预处理：
（1）切片常规脱蜡；
（2）0.2mol/L HCl处理10min; (3)5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min; (4)Nase消化组织37℃ 30min; (5)梯度酒精脱水，室温干燥。 2）原位扩增：
（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；
（2）PCR热循环：94℃，1min;55℃，1min;72℃，1.5min，共25~30个循环，72℃延伸10min; (3)氯仿洗去盖玻片，4%多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。
3） 原位杂交：
（1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜。
（2）杂交后用2*SSC洗涤10min,3次，1*SSC洗涤10min,3次；
（3）缓冲液洗涤10min,3次；
（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h; (5)缓冲液洗涤5min,3次；
（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。
（7）常规脱水：透明、封固。
2、原位RT-PCR步骤 1）预处理：
（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗；
（2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。 2）原位扩增：
（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；
（2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。
再将热循环仪设定为95℃，45s,55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；
（3）扩增结束后，在80℃烤15min~30min。 3）原位杂交：
（1）杂交前标本95℃加热3min; (2)加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25%硫酸葡聚糖，2*SSC,50%甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA， 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。 (3)扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600（链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝）检测。
阳性反应呈紫色。
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