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通过引物的参数检测
引物设计参数:
a
引物长度一般在20bp左右,上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度,不同软件TM使用不同的算法,primer3,primer
5,primer
6,primer
express等一般可以设置在55-58度,beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求,40-60最好,如果不好设计,30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以,不要在50bp左右,那样和引物二聚体不好区分,超过200bp可能会影响PCR扩增。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配,特别是3`端不能有碱基匹配,那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后,在NCBI上做一个primer-blast,检测一下是否有非特异性扩增。
最好还是通过实验验证,如果是定量PCR引物
a
溶解曲线单峰,窄而尖,否则可能有非特异性扩增;峰的位置横坐标一般在80度以上,这个温度为PCR产物的解链温度,如果在75度附近,可能是引物二聚体,miRNA染料法检测时,溶解曲线的峰的位置可能在75度附件
b
琼脂糖电泳为明亮的一条带,条带一般在100bp以上,如果设计引物时PCR产物在100bp一下,需要仔细辨认是否为引物二聚体;引物二聚体的条带一般在50bp左右,条带弥散,暗。
c
扩增曲线呈“S”形,一般情况下,S形越陡,扩增效率越高,S形越平,扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期,没有指数期的情况,这时一般扩增效率较低,建议检测一下扩增效率,用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。
d
样品Ct值小于30,对于Ct大于30的情况,建议重新设计一对引物,重新调试。如果几对引物的Ct值都较大,可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。
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