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因为不清楚你所扩增的全长片断、以及Overlap过程中要搭在一起的两个片断各是多长，所以无法提供非常具体的意见。谈一点我的经验，供参考。overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（你的试验中25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且你使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。

另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。 当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。

得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。所以建议你使用TouchDown PCR试试。TouchDownPCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。Touch Down PCR有利于解决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。

其他的可尝试的地方，也可以试试加用一些变型剂，如甲酰胺、DMSO等。也可同Touch Down PCR配合使用。但建议先单纯试试TouchDown PCR。...

以下为关联文档：

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