[小鼠胚胎干细胞培养实验步骤]以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。 1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明...+阅读

[摘要] 目的 建立护骨素(OPG)基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型，为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础。方法 PCR方法扩增两条同源臂，将两条用于同源重组的片段插入XpPNT载体，构建OPG基因敲除打靶载体。线性化及纯化以后通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞，并用G418和Gancyclovir进行双药筛选培养，得到双药抗性克隆后抽提基因组DNA，采用PCR和southern杂交方法确定同源重组的胚胎干细胞克隆。 结果 经双药筛选得到124个双药抗性克隆，PCR和southern杂交鉴定获得一个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论 总之，本研究成功获得了OPG(-/+)杂合子小鼠胚胎干细胞克隆，为进一步通过显微注射及交配育种获得OPG基因剔除小鼠，在活体水平研究OPG基因的功能打下基础，同时也使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能。

[关键词] 基因敲除；胚胎干细胞；护骨素；骨质疏松

Establishing the heterozygous model of OPG gene knockout ES cell

QIAO Jianou,ZHOU Longnv,NING Guang,et al.The 9th Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200232,China

[Abstract] Objective To obtain the homologous rebinant embryonic stem cell (ES cell )with their OPG gene knocked out. Methods A targeting vector pointing to OPG exon 2 and a little part of intron 2 was built with 3.3kb Xbal/BamHI fragment as short arm and 3.9kb NotI/SalI fragment as long arm after two homology arms was got by PCR.The linearized and purified targeting vector DNA was transfected into ES cells through electroporation and then some of these ES cell lines survived G418 and Gancyclovir selection.Twodrugresistant clones were expanded and identified by PCR and Southern blot. Results Totally 124 twodrugresistant clones were harvested and one of them was confirmed as positive. Conclusion The result of this experiment made basis for the further establishment of the OPG knockout mouse model and the deeper study of OPG in vivo.

[Key words] knockout;ES cell;osteoprotegerin;osteoporosis

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病，也是影响人类健康的常见病。如何建立一个特异的动物模型是相关领域的一个热点。护骨素(osteoprotegerin,OPG)是近年来发现的具有抑制破骨细胞分化及吸收活性的一种分泌型糖蛋白[1]，属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族。研究表明，OPG在骨质疏松症、风湿性关节炎、Paget病以及恶性骨组织疾病(骨肉瘤，巨细胞瘤，转移性癌)等的发病机制、预防和治疗中具有重要作用。本研究利用分子克隆方法，设计并构建针对小鼠OPG基因第2外显子大部分以及部分第2内含子的打靶载体，采用基因打靶的技术手段，剔除小鼠ES细胞OPG基因,为进一步通过显微注射制备OPG基因剔除小鼠模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 载体质粒pBlueⅠⅠ(+/-)和XpPNT质粒由上海南方模式生物中心提供，PCR产物克隆载体pGEMTeasy为Promega公司产品。各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、随机引物法DNA标记试剂盒,各种Taq酶、PCR相关试剂及RTPCR试剂盒等购自Takara及NEB公司。DNAmarker(100bp ladder，1kb ladder，Lamda-HindIII fragment)购自NEB和Takara公司。蛋白酶K购自上海生工生物工程技术服务公司。Trizol购自GibcoBRL和Invitrogen公司。质粒小量抽提试剂盒购自华舜生物工程公司和上海生工。质粒中抽试剂盒及凝胶回收试剂盒(Quick gel extraction Kit)购自Qiagen公司。杂交液ExpressHyb hybrization solution购自Clontech公司。常规化学试剂主要购自Sigma和中国医药集团上海化学试剂公司。放射性同位素[α-32P]-dCTP、[α-32P]-dATP为Amersham公司产品。细胞培养相关试剂:包括DMEM液体培养基(high glucose,Lglutamine,no sodium pyrate,EScellqualified)、非必需氨基酸、谷氨酰胺、无Ca2+/Mg2+的PBS、含Ca2+/Mg2+的PBS、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、胎牛血清(EScellqualified)、G418，Gancyclovir(GANC)、二甲基亚砜(DMSO)、青霉素/链霉素、胰蛋白酶(trypsin/EDTA)、胶原(Gelatin)等试剂均为GibcoBRL、Sigma公司产品,LIF(ESGROTM)为CHEMICON(Australia)公司产品。细胞培养用35 mm、100 mm细胞培养皿，24孔、48孔和96孔细胞培养板,离心管等耗材为Corning产品。引物合成和测序：由上海申友生物技术公司完成。引物序列用DNAstar软件包根据序列资料自行设计。ES细胞株：体外传至第13代的小鼠，CJ7细胞系(来自Sv129小鼠)由上海第二医科大学基础医学院医学遗传教研室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 打靶载体的构建

1.2.1.1 提取ES细胞基因组DNA 收获状态良好的ES细胞，加适量裂解液及蛋白酶K，56 ℃过夜；次日将样本于室温12000 rpm离心10 min；取上清液，无水乙醇沉淀，冰预冷70%乙醇洗涤；晾干后，适量纯水溶解，4 ℃保存备用。

1.2.1.2 PCR方法获得两条同源臂 以小鼠的OPG基因cDNA序列在Genebank中比对(BLAST)，获得小鼠OPG基因序列。根据NCBI GenBank提供的序列，用DNAstar软件的Primerselect确定上、下游两条同源臂的两对引物，上游同源臂的上游引物：CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT(对应OPG基因14842-14861bp) ；下游引物:TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA(对应OPG基因18152-18171bp)；PCR条件：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;60 ℃，50 s;72 ℃，3.5 min。35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。上游同源臂长3331 bp。下游同源臂的上游引物：ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT(对应OPG基因18580~18598bp)下游引物：GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA(对应OPG基因22478~22497bp)；PCR条件为：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;61.5 ℃，50 s;72 ℃，4 min.35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。下游同源臂长3918 bp。

1.2.1.3 将DNA片段正确克隆于XpPNT载体 将两条同源臂的PCR产物回收并连接至PCR产物克隆载体pGEMTeasy，大肠杆菌转化扩增后测序鉴定。常规法将下游同源臂以NotI/SalI导入载体XPpnT,再将上游同源臂以Xbal/BamHI插入已经含有上游同源臂的XPpnT载体。酶切鉴定及序列测定表明，连接顺序正确，将此打靶载体命名为5-3opg-XpPNT,以NotI酶切线性化，回收，-20 ℃保存备用。

1.2.2 ES细胞基因打靶

1.2.2.1 ES细胞电穿孔基因转移 取密度约1.2×107/ml的ES单细胞悬液0.8 ml，加入含Ca2+和Mg2+的PBS0.1 ml(含约30 μg经NotI线性化的5-3opgXpPNT)，混匀后移入无菌电穿孔杯中。常温条件下，以240 V，500 μF的电参数进行单脉冲击发后，重新悬浮于ES培养基,取细胞悬液平均接种到2个胶原化的35 mm平皿中,使用非选择性培养基复苏24 h后进行药物筛选。

1.2.2.2 药物筛选抗性细胞 在细胞电穿孔基因转移后24 h开始进行药物选择。其中1个30 mm的平皿使用含有选择药物G418(终浓度为400 g/ml)和Gancyclovir(终浓度为2 mmol/L)的培养液进行选择性细胞培养，另1个平皿仍然使用非选择性培养基培养作为对照。经7~8天筛选，ES细胞克隆长成肉眼可见的细胞集落，即可进行挑取。14天共挑取药物抗性细胞克隆124个。