[PPPoE的验证方法以及对其的利用]一、前言 近年来，网络数据业务发展迅速，宽带用户呈爆炸式的增长，运营商在采用xDSL，LAN，HFC，无线等多种接入方式的同时，为了构建一个可运营、可管理、可盈利的宽带网络，十分关心如何...+阅读

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法.检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查. 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内进行.检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出.单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证. 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性. 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃~35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃~28℃. 检验结果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告. 检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm2）. 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重品、微量包装品的检验量可以酌减.要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）. 检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片. 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品. 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液.供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃.供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时. 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下. 1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10 的供试液.油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液. 2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10 的供试液.必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀. 3.需用特殊供试液制备方法的供试品

（1）非水溶性供试品方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20 的供试液. 方法2 取供试品10g，加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯（采用薄膜过滤法过滤除菌.选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140℃干热灭菌2小时）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解.然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5~10 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10 的供试液.

（2）膜剂供试品取供试品100cm2，剪碎，加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1∶10 的供试液.

（3）肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1∶10 的供试液.

（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出.用无菌器吸出全部液，加至适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1∶10 的供试液.

（5）贴剂供试品取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上.用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起.然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30 分钟，制成供试液.贴剂也可以其他适宜的方法制备成供试液.

（6）具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性后，再依法检查.常用的方法如下. ①培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用.测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数.每1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量. ②离心沉淀法 取一定量的供试液， 500 转/分钟离心3 分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查. ③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”. ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分.中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中. 细菌、霉菌及酵母菌计数计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计...

青霉素钠无菌检查的方法验证

目的 建立健全青霉素钠无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。

方法 采用薄膜过滤法进行。

1.培养基及其制备方法

培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处 方生产的符合规定的脱水培养基。以下培养基制备时，均以115℃灭菌30分钟。 1.需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基） 酪胨（胰酶水解） 15g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml L-胱氨酸 0.5g （或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml） 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.5~0.7g （或硫乙醇酸0.3ml） 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性， 煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装， 灭菌。 在供试品接种前， 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则，须 经水浴煮沸加热， 只限加热一次。

2.选择性培养基

(1) 对氨基苯甲酸培养基（用于磺胺类药物的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌 培养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀，分装，灭 菌。 （2） 聚山梨酯80培养基（用于油剂药品的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌培养基 及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80，摇匀，分装，灭菌。

3.操作

按该药品项下规定的方法处理后， 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中， 混合后，通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养24~48小时，真菌应在培养24~72小时有菌生长。结果判断当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定。

结果判断 如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

讨论 目前，抗生素类药物的应用非常广泛，针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准，提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时，对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法。试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以，该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

法莫替丁微生物限度检查方法学验证

2015版药典微生物学拟收载情况 检查法 ①无菌检查法 ②非无菌药品微生物计数法 ③非无菌药品控制菌检查法 ④抑菌剂效力检查法 ⑤灭菌法 ⑥生物指示剂抗性检查法 ⑦中药饮片的微生物限度检查法 标准 非无菌药品微生物限度标准 指导原则 非无菌药品微生物限度检查指导原则 制剂通则中 制剂通则中有关制剂项下的无菌和微生物限度检查要求的修订 制剂通则中有关制剂项下的[无菌]和[微生物限度]检查要求的修订

（1）为保证用药安全，眼用液体、半固体制剂仍应符合无菌检查法的规定

（2）为保证用药安全，对用于手术、创伤、烧伤的外用制剂如鼻用制剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、涂剂、滴耳剂等仍应符合无菌检查的规定。但在其通则无菌检查项下增加：“除另有规定外”。给予有不按无菌检查的原因

（3）在搽剂和酊剂通则项下的微生物限度检查项下增加：“除另有规定外” 。给予有可能需要按无菌检查的原因 品种正文中的无菌或微生物限度检查及其标准要求

1、受热不稳定、制剂不能进行最终灭菌的无菌工艺产品如：抗生素原料药、抗生素粉针剂正文中无菌检查的规定

2、经验证后各论化品种检查项下的：无菌…..或微生物限度……（有具体检查的规定）

3、药用敷料的无菌或微生物限度要求及标准

4、纯化水、注射用水的微生物限度要求及标准 2015年版药典的纯化水、注射用水[微生物限度]价差方法在参考欧、美药典只要用水微生物检查要求的基础上，由浙江所立课题考察、比对，在所用培养基和方法上将有较大的修订与USP35版、EP7.0版、JP16版比较，2015年版中国药典微生物学检验体系规划收载的项目和内容已基本趋向一致，将使我国药典的微生物学检验成为一个比较完备的标准体系，其意义在于： 1）全面与国际药典标准接轨； 2）从对终产品的检验向过程控制转变。 2015年版微生物学检验中的重大修订及意义

1、实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 ②微生物限度检查环境洁净度规定

2、培养系统的重大修订 ①无菌检查中培养基的修订 ②微生物计数法中培养基的修订 ③控制菌检查法中培养基的修订 ④控制菌检查法中培养基的修订 ⑤抑菌效力测定法中培养基的修订

3、对

一、

二、三部微生物学附录的整合、修订 与USP35版、EP7.0版、JP16版比较，2015年版中国药典微生物学检验体系规划收载的项目和内容已基本趋向一致，将使我国药典的微生物学检验成为一个比较完备的标准体系，其意义在于： 1）全面与国际药典标准接轨； 2）从对终产品的检验向过程控制转变。 培养基系统的重大修订 修订依据： 通过科研课题的建立及大量实验，以国际品牌培养基为对照，考察了中国药典微生物限度检查法、无菌检查法中所用国产培养基与USP/BP/JP中所规定的培养基的粗军生长能力比较，得出大量的实验数据，并经过可靠的统计分析名为整体微生物检验培养基的修订提供了有利的技术支持。 修订意义：

（1）纠正了我国在微生物检验系统中长期存在的对微生物分了培养的概念，提高污染微生物的检查可能。

（2）与先进国家药典所用培养基一致，为实现结果夫人打下重要基础。 对

一、

二、三部微生物学附录的整合、修订 需进行整合、修订的微生物学检验记录： ①无菌检查法 ②微生物检查法 ③指导原则 微生物限度检查法应用指导原则 药品微生物实验室规范指导原则 中国药典2015年版微生物限度检查法增、修订

1、微生物限度检查法收载形式的增、修订

2、实验环境的增、修订

3、微生物计数法中的增、修订

4、控制菌检查法中的增、修订

5、非无菌药品微生物限度标准的整合、修订 《中国药典》2015年版微生物限度检查法修订后将分为三个附录：

1、非无菌药品微生物限度检查：微生物计数法

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